Le noyau initial des Musées du Vatican était constitué par la collection de sculptures commencée par Jules II (1503-1513) et alors exposée dans la "Cours des statues", aujourd'hui Cours Octogonale. Les Papes furent les premiers souverains à mettre à la disposition de la culture et du public leurs collections d’art privées. Dans leur structure de collections d’art organisées dans des bâtiments accessibles au public, les Musées et les Galeries Pontificales naissent sous Clément XIV (1769-1774) et Pie VI (1775-1799) et, pour cette raison, la section emménagée sous ces deux Papes prit les nom de Musée Pio-Clementino. Pie VII (1800-1823) agrandit considérablement les collections d'Antiquités Classiques, en y ajoutant le Musée Chiaramonti et le Braccio Nuovo et enrichit considérablement la collection épigraphique exposée dans la galerie lapidaire. Grégoire XVI (1831-1846) fonda le Musée Etrusque (1837) avec les pièces provenant des fouilles de l’Étrurie méridionale réalisées à partir de 1828, le Musée Egyptien (1839) avec les monuments égyptiens provenant d’explorations faites en Egypte et avec ceux qui se trouvaient déjà au Vatican et au Musée du Capitole, le Musée Profane du Latran (1844) avec des statues, des bas-reliefs et des mosaïques d'époque romaine qui ne pouvaient prendre place dans les édifices du Vatican. Au Musée Profane du Latran, Pie IX (1846-1878) ajouta en 1854 le Musée Chrétien, comprenant la statuaire antique chrétienne, en particulier des sarcophages et des inscriptions. Sous le pontificat de Saint Pie X (1903-1914), en 1910, fut ajouté le Musée Lapidaire Juif: une section contenant 137 inscriptions d’antiques cimetières juifs de Rome, pour la plupart provenant du cimetière de la Via Portuense et données par les propriétaires, les marquis Pellegrini-Quarantotti. Ces dernières collections (Musée Grégorien Profane, Musée Pie Chrétien et Lapidaire Juif) ont été transportées, sous Jean XXIII (1958-1963), du Latran à un nouveau bâtiment spécialement construit au Vatican; en 1970 ces collections ont été réouvertes au public. Font également partie des Musées: la Galerie des Tapisseries, avec une collection de tapisseries de diverses manufactures des XVIème et XVIIème siècles; la Galerie des Cartes géographiques, décorée par Grégoire XIII (1572-1585) et restaurée par Urbain VIII (1623-1644); les salles Sobieski et de l'Immaculée Conception; les Stanze et la Loge de Raphaël, faites décorées par Jules II et Léon X (1513-1503); la chapelle du Beato Angelico, peinte sous le pontificat de Nicolò Borgia (1447-1455) ; la Chapelle Sixtine, qui prend le nom de son fondateur Sixte IV (1471-1484), l’appartement Borgia, habitation d’Alexandre VI (1492-1503), la Pinacothèque du Vatican, placée dans un édifice spécial près de la nouvelle entrée des Musées par Pie XI en 1932; le Musée Missionaire-Ethnologique fondé par Pie XI en 1926, emménagé aux étages supérieurs du Palais du Latran, et successivement transporté, selon le souhait de Jean XXIII, au Vatican où il a été réouvert au public dans le même bâtiment qui accueille les collections précédemment exposées au Latran. La collection d’art religieux moderne et contemporain fut ajoutée en 1973 et inaugurée par Paul VI (1963-1978) dans l’appartement Borgia. Le musée historique, fondé lui aussi en 1973 et inauguré en 1987 dans l’appartement papal du Palais du Latran, réunit une série iconographique des Papes et des reliques des Corps militaires pontificaux et de la Chapelle et Famille pontificale, également pour les charges désormais supprimées; et enfin une documentation des cérémoniaux aujourd'hui abandonnés. La section des carrosses et voitures papales est restée au Vatican. Depuis le début de l'an 2000, les Musées du Vatican accueillent les visiteurs dans la nouvelle et spacieuse entrée où ils trouvent les services d’accueil, enrichie par diverses œuvres d'art dont deux ont été réalisées à cette intention.